在成像時保持染料的光譜重疊盡可能低至關重要，但在如此高密度的多標記樣本中，串色無法wanquan避免。

在這種超多標水平上，拆分工具提供了一種識別和量化每個標記物貢獻的方法。

傳統方法中，單獨染色一個樣本（每個標記物一個）作為拆分的對照和起點。對照樣本中獲取的信息用于構建拆分矩陣。單染色方法比較繁瑣，因為這需要大量的樣本和精力，來創建與多重標記數量相同數量的樣本。

計算出拆分矩陣后，使用相應的設置對完整的15標樣本進行采集。拆分后的數據會自動生成（圖 3），并附上對應的原始圖像，方便后續分析和解釋。帶有所有生物相關通道的樣本片段展示了單輪染色方法的豐富信息（圖3a）。

癌癥樣本的詳細視圖展示了不同的微環境。例如，富含淋巴細胞的區域（B 和T細胞）展示了免疫系統在腫瘤中已經開始執行功能（圖3b）。這些淋巴細胞大多具備免疫功能，直接或間接抵抗腫瘤生長（圖3c中TCF1和PD1的表達），其中部分細胞還具有調節作用（圖3c中FoxP3的 表達）。髓系細胞在腫瘤中通常更為常見，功能各異，可發揮抗腫瘤或促腫瘤作用，其空間分布在很小尺度上呈現顯著差異（圖3d）。

樣本中的癌癥、基質和細胞外基質標記物表現出較高的異質性。雖然這些標記物的分布較為復雜（例如，成纖維細胞的細胞過程），但它們也明顯覆蓋了大片上皮和內皮細胞區域（圖3e–g）。高級拆分程序確保在組織內準確識別不同的細胞類型及其功能狀態（例如，免疫細胞亞型、組織決定因子和疾病決定因子）。

總體而言，建立一種穩健、快速且靈活的3D成像方法以評估癌癥組織對于解析腫瘤微環境的變化至關重要。該成像工作流程的高效性可以加速結果評估、決策制定，并為后續實驗設計提供有力支持。

一次性成像方法為此工作流程帶來了兩項關鍵優勢。首先，能夠對與癌癥標記物相關的感興趣區域（ROIs）進行深入探索，例如在不同放大倍數和更高分辨率下進行更詳細的空間特征分析。其次，所有標記物在三維環境中同時存在，確保在組織中發現的相互作用置于其預期或意料之外的組織微環境中進行分析。

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