免疫系統對癌癥治療的反應可以反映患者在治療之后是否會有良好的結果。了解腫瘤微環境（TME）在腫瘤發生和治療反應中的變化對制定個性化的治療方案并改善癌癥治療至關重要。借助穩定和全面的超多標成像技術，可使用免疫標志物探查髓系和淋巴系細胞的譜系和結構，而且結合特定腫瘤生物標志物時，還可以捕捉多種腫瘤中TME內的免疫反應。細胞類型特征模式，結合超多標組織成像的探查能力，可以針對免疫細胞群和TME內眾多類型細胞的空間相互作用提供之前無法獲得的全新認識。

Cell DIVE超多標成像分析整體解決方案可以使用循環染色和染料失活流程對一個完整組織切片上的數十個生物標志物進行檢測和成像。Cell DIVE的核心是一個精確、靈活、開放的多標記成像解決方案，可以靈活選擇多標記成像研究中常用的生物標志物抗體。Cell Signaling Technology(CST)擁有豐富的經IHC驗證的抗體組合，可檢測TME中的關鍵蛋白質，實現組織中的免疫細胞檢測和表型判斷。CST提供抗體偶聯物，這些偶聯物均經過驗證，可用于Cell DIVE上，并提供經IHC驗證抗體與熒光團和其他檢測試劑的定制化偶聯。CST采用嚴格的IHC驗證方法，隨后還會在Cell DIVE平臺上進行驗證，可確保成功檢測蛋白質。

在本研究中，我們展示了使用由數十種CST生物標志物抗體^™組成的新型檢測模式，在多種組織類型中進行的Cell DIVE超多標成像。多標記檢測模式的開發所需的優化極少，可識別復雜的細胞類型，并揭示腫瘤微環境中的細胞間相互作用。

表征腫瘤微環境有助于理解導致患者預后不佳的新機制。腫瘤微環境比較復雜，通常在單個樣本和不同患者樣本中都是異質的。循環多標記染色和成像可在不同組織樣本中實現TME探查，即使可用組織有限的情況下。在這項研究中，我們檢查了12個完整組織或TMA切片中30多個生物標志物的表達（表1），重點是潛在的免疫治療目標、預測性生物標志物和分割標志物。所有的CST生物標志物抗體均被連接并隨機分配到一個回合。

為了在TME中其他細胞的背景下定義免疫細胞，融合并分割了所有的生物標志物圖像，并使用聚類分析和降維（UMAP）對表達進行分析。聚類分析提供了一個無偏見的方法來定義組織內的免疫細胞貢獻。

在這項研究中，我們展示了人類結腸腺癌（CAC；圖1）的聚類分析。在這里，聚類分析將白細胞從所有其他上皮細胞和基質細胞類型中區分出來（圖1C）。此外，聚類清楚地定義了淋巴細胞和骨髓細胞類別。CAC中的骨髓類亞型包括骨髓祖細胞、M2巨噬細胞和另外兩個未知亞型的骨髓聚類。其他生物標志物可用于進一步定義亞型。對于淋巴類，定義了T細胞和NKT細胞聚類。另外，還確定了一個具有CD20陽性的T細胞聚類。使用機器學習進行單細胞表型分析，可以從聚類中進一步定義細胞類型。例如，在圖像1D中，聚類15中的一個細胞是CD45+ CD3+ CD8+ CD4+ GRZB+ Ki67+ LAG3+ PD1+TIM3+（圖1D-E；橙色圈）。聚類和單細胞空間分析被應用于研究中的所有其他組織（圖2；數據未顯示）。

CST抗體經過了嚴格的驗證，以確保抗體在FFPE組織上的表現。本研究中的所有抗體都是直接偶聯或商業偶聯物成品（表1）。偶聯是使用非位點特異性化學方法進行的。抗體與四種不同的染料過量偶聯，去除未結合的染料，并通過分光光度分析測量標記的程度。經過初步驗證，具有*佳標記程度和濃度的偶聯抗體溶液隨后用于對各種人類癌癥組織和正常組織的染色。組織從商業來源獲得（Pantomics；表1）。在Cell DIVE上使用四通道+DAPI對組織進行成像，并自動進行自發熒光去除、校正和拼接。使用徠卡顯微系統開發的zhuanli軟件全拼接圖像進行導入、融合和分析。